Bayreuther Wissenschaftler entschlüsseln Molekül­strukturen der Spinnen­seide

Bayreuther Wissenschaftler entschlüsseln Molekül­strukturen und Teile des Assemblierungs­mechanismus der Spinnenseide. Spinnenseide ist ein faszinierendes Material: Belastbarer als Stahl, dehnbarer als Nylon, und dünner als ein menschliches Haar. Sie lässt sich ohne Rück­stände biologisch abbauen, löst keine Allergien aus und kann bis zu einem Viertel ihres Eigen­gewichts an Wasser auf­nehmen.

Doktorand Joschka Bauer M.Sc. und Doktorandin Vanessa Trossmann M.Sc. im Labor.
Mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden konnten die Gene der Seidenproteine von der Schwarzen Witwe auf Darmbakterien übertragen werden. Im Labor: Doktorand Joschka Bauer M.Sc. und Doktorandin Vanessa Trossmann M.Sc. © Christian Wißler

Wie gelingt es der Spinne, dieses einzig­artige Material herzu­stellen, das wie keine andere Faser der­artige Vor­züge vereint? Die molekular­biologischen Forschungen am Lehr­stuhl für Bio­materialien der Universität Bayreuth haben in den letzten Jahren entscheidend dazu beitragen können, Licht in diese Künste der Spinne zu bringen. Für deren Verständnis ist es zunächst wichtig, sich den allgemeinen Bauplan der Spinnen­seide vor Augen zu führen. Der Spinnen­seiden­faden besteht aus einem Netz­werk an Seiden­proteinen, die sich jeweils aus drei Abschnitten zusammen­setzen, sogenannte Domänen: Eine große Kern­domäne besteht aus kurzen, sich wieder­holenden Amino­säure­sequenzen ähnlich einem molekularen LEGO-Gebilde, das sich aus immer wieder­kehrenden Einzel­bau­steinen (die alle gleich aussehen) zusammen­setzt. Die Kern­domäne wird an beiden Enden von einzig­artigen Domänen (sozusagen von ‚Sonder-Bausteinen‘) flankiert. Diese werden in Bezug auf eine freie Amino­gruppe als ‚N-terminale Domäne‘ und in Bezug auf eine Carboxyl-Gruppe als ‚C-terminale Domäne‘ bezeichnet.

Während sich verschiedene Seiden­proteine hinsichtlich der Amino­säure­sequenz in den Kern­domänen unter­scheiden, weisen sie eine hohe Identität in ihren End-Domänen auf. Die Bayreuther Forschungs­gruppe um Prof. Thomas Scheibel hat heraus­gefunden, dass die außer­ordentlichen Eigenschaften der Spinnen­seide wesentlich den Strukturen zu verdanken sind, die aus diesen ‚drei­teiligen‘ Proteinen gebildet werden. Die Entstehung des Spinnen­seiden­fadens ist ein fein differenzierter Prozess, der sich in verschiedenen Abschnitten der Spinnen­drüse abspielt.

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Im Drüsensack der Spinne: Proteine in wässriger Lösung

Zunächst einmal finden sich die einzelnen, im Drüsen­gewebe synthetisierten Proteine im Drüsen­sack der Spinne zusammen. Hier bilden sie, wie die Bayreuther Wissen­schaftler heraus­gefunden haben, kugel­förmige Strukturen (Mizellen), die Eigen­schaften von Flüssig­kristallen aufweisen. Bereits in diesem Stadium beginnt die Vernetzung: Jeweils zwei Proteine lagern sich parallel zueinander an und verklammern sich über ihre C-terminalen Domänen. Diese Klammer wird durch eine chemische Bindung (Disulfid­brücke) noch verstärkt. So entstehen jeweils Dimere: Paare von Seiden­proteinen, die an ihrem einen Ende zusammen­gebunden sind und an den zwei losen Enden von den zunächst partner­losen N-terminalen Domänen begrenzt werden. Dies gewähr­leistet, dass die Protein­ketten sich in der wässrigen Lösung frei bewegen können und nicht verklumpen. Diese gute Löslich­keit wird durch die wasser­liebenden C- und N-terminalen Domänen vermittelt, die sich auf der Ober­fläche der Mizelle befinden.

Im Spinnkanal: Übergang zum reissfesten Material

Der Übergang von einer Protein­lösung zu einem Seiden­faden wird forciert, sobald die Spinne die Dimere in den Spinn­kanal drückt. Jetzt ändert sich die chemische Umgebung der Proteine: Der pH-Wert sinkt schritt­weise von 7.2 auf 6.0, und der Salz­gehalt verringert sich. In einer kürzlich veröffentlichten Studie 1 hat die Bayreuther Forschungs­gruppe herausgefunden, dass diese neuen Umgebungs­bedingungen in den N-terminalen Domänen Umstrukturierungs­prozesse auslösen, die für die Entstehung eines reiß­festen und elastischen Seiden­fadens ganz entscheidend sind. Die N-terminalen Domänen weisen nämlich zwei räumlich getrennte Bereiche auf ihrer Ober­fläche auf.

Ein hochleistungsfähiges Produkt: Spinnenseidenfasern aus biotechnologisch hergestellten Proteinen mit naturidentischen mechanischen Eigenschaften.
Ein hochleistungsfähiges Produkt: Spinnenseidenfasern aus biotechnologisch hergestellten Proteinen mit naturidentischen mechanischen Eigenschaften. © Fa. AMSilk, Planegg/Martinsried

Diese enthalten saure Amino­säure­seiten­ketten, die bei neutralem pH-Wert (pH 7) eine negative Ladung aufweisen – und zwar deshalb, weil sie im Drüsen­sack Protonen an ihre Umgebung abgegeben haben. Im Detail lassen sich innerhalb der Domäne eine Glutamin­säure an Position 114 (‚E114‘) sowie eine räumlich davon entfernte Gruppe von Asparagin- und Glutamin­säuren an den Positionen ‚D39‘, ‚E76‘ und ‚E81‘ unter­scheiden. Das Absenken des pH-Wertes im Spinn­kanal bewirkt, dass die zunächst negativ geladenen Amino­säure­reste mit positiv geladenen Protonen bestückt werden. Anders gesagt: Sie werden ‚protoniert‘, und ihre negative Ladung wird neutralisiert.

Die Spinnenseidenproteine werden rekombinant in Bakterien hergestellt. Um an die Proteine zu gelangen, schließt Joschka Bauer M.Sc. die Zellen mit Hilfe eines Hochdruck-Homogenisators auf. Die Spinnenseidenproteine werden rekombinant in Bakterien hergestellt. Um an die Proteine zu gelangen, schließt Joschka Bauer M.Sc. die Zellen mit Hilfe eines Hochdruck-Homogenisators auf. © Christian Wißler

Die Bayreuther Wissen­schaftler haben nun am Beispiel einer Seiden­domäne der Schwarzen Witwe im Detail auf­geschlüsselt, wie diese Vorgänge die N-terminalen Domänen beeinflussen. Dafür haben sie zunächst die genetische Information für die N-terminale Domäne eines Seiden­proteins aus der Schwarzen Witwe gewonnen. Mit Hilfe von mole­kular­bio­logischen Techniken wurde das zuständige Gen an den inter­essantesten Positionen (Amino­säuren) mutiert. Anschließend wurden sowohl das originale Wild­typ­gen wie auch die neu designten (mutierten) Gene auf Darm­bakterien des Stammes Escherichia coli über­tragen (Abb. 3). In Bio­reaktoren wurden die E. coli anschließend kultiviert; dabei produzierten sie die N-terminale Domäne und ihre Varianten. Solche Proteine, die mit gentechnisch veränderten Organismen bio­techno­logisch hergestellt werden, nennt man in der Forschung ‚rekombinante Proteine‘. Nachdem die bakterien­eigenen Proteine von den Spinnen­seiden­proteinen abge­trennt waren, konnten die rekombinanten N-terminalen Domänen nun mit Hilfe bio­chemischer Methoden charakter­isiert werden.

Dabei stellte sich folgendes heraus: Die Protonierung von Amino­säure E114 bewirkt, dass jede N-terminale Domäne eine zweite N-terminale Domäne als Partner findet. Dabei stabilisieren elektro­statische und hydro­phobe Wechsel­wirkungen die anti­parallel zueinander ausge­richteten Domänen. Da in der Drüse der Spinne bereits jeweils zwei Proteine über die C-terminale Domäne verbunden sind, führt die Dimerisierung der N-terminalen Domäne zur weiteren Quer­vernetzung der Seiden­proteine. Dies ist der Start­punkt für eine Verknüpfung zu einem langen Molekül, im Prinzip könnte die Verknüpfung end­los fort­gesetzt werden.

Damit die Bindung zwischen den zwei N-terminalen Domänen stabilisiert wird, bedarf es eines zusätzlichen un­ab­hängigen Prozesses, der von einer räumlich entfernten Gruppe aus Amino­säuren kontrolliert wird. Die Protonierung der Seiten­ketten D39, E76 und E91 löst einen Struktur­wechsel – die Forschung spricht von einer Konformations­änderung – der N-terminalen Domäne aus. Durch die Struktur­änderung können zusätzliche Bindungen zwischen beiden N-terminalen Domänen ausgebildet werden.

Diese Erkenntnisse wurden unter anderem durch den Einsatz der magnetischen Kern­resonanz­spektros­kopie (NMR) in enger Zusammen­arbeit mit der Gruppe von Prof. Stephan Schwarzinger am Lehr­stuhl für Bio­poly­mere gewonnen. Mittels NMR-spektro­skopischer Unter­suchungen konnte die Protein­struktur der N-terminalen Domäne präzise bestimmt werden. So ließen sich ziel­genau die Aminosäuren identifizieren, die einer­seits an der Dimerisierung, andererseits an der Struktur­änderung beteiligt sind. Das Netz­werk aus quer­vernetzten Seiden­proteinen wird im engen Spinn­kanal in Längs­richtung auf­grund von Scher­kräften aneinander­gepresst. Die entstehenden Protein­stränge lagern sich zu einem Seiden­faden zusammen, der schließlich von der Spinne aus der Spinn­düse heraus­gezogen wird. Dass die Quer­vernetzung der Proteine, ihre Assemblierung, von der N-terminalen Domäne präzise kontrolliert wird, ist entscheidend für die Entstehung eines Seiden­fadens mit einer in der Natur un­über­troffenen Kombination von Reiß­festig­keit und Elastizität.

Spinnen wie die Spinne: Biomimetische Anwendungen

Auf der Grund­lage der bis dahin erzielten molekular­biologischen Erkenntnisse ist es dem Forschungs­team um Prof. Thomas Scheibel im Jahr 2013 erst­mals gelungen, Seiden­fäden herzu­stellen, welche die gleiche mechanische Belast­bar­keit wie natürliche Spinnen­seide auf­weisen. Bei dieser bio­techno­logischen Herstellung der Seiden­proteine im Labor wurden keine Spinnen, sondern speziell präparierte E. coli-Bakterien ein­ge­setzt. Heute verfügt der Lehr­stuhl über eine Spinn­anlage, mit der mit Hilfe der Bakterien im Labor her­gestellte Seiden­proteine in stabile Fasern versponnen werden können.

Damit wurde die Tür zu einer noch un­ab­seh­baren Viel­falt neuer Materialien und neuer Produkte auf­gestoßen, die nicht zuletzt für die Bio­medizin von großem Interesse sind. Die Bayreuther Wissen­schaftler haben mit Hilfe einer weiteren Ver­arbeitungs­techno­logie bereits eine Bio­tinte aus Seiden­proteinen entwickelt. Damit können zukünftig im 3D-Drucker komplexe Gewebe produziert werden, die zum Beispiel bei Organ­transplan­tationen ange­wendet werden können. Des Weiteren wurden Um­mantelungen für Brust­implantate entwickelt, die geeignet sind, schmerz­hafte ent­zündliche Gewebe­verkapselungen zu vermindern. Cremes aus Seiden­proteinen, die bereits im Handel erhältlich sind, sorgen für eine ausreichende Feuchtig­keit der Haut, schützen diese vor Umwelt­einflüssen und verleihen ihr einen natürlichen Glanz.

Mehr Informationen finden Sie unter: www.biofabrication.uni-bayreuth.de/en/

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